影響無菌制劑無菌保證水平的因素
發(fā)布日期：2022/2/8 16:20:08 訪問次數(shù)：972
藥品是特殊商品，關(guān)系到人們的生命安全。《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》 ( good manufacturing practice，GMP) 2010 年修訂附錄1無菌藥品第三條指出：“無菌藥品的生產(chǎn)必須嚴格按照精心設(shè)計并經(jīng)驗證的方法及規(guī)程進行，產(chǎn)品的無菌或其他質(zhì)量特性，決不能依賴于任何形式的最終處理或成品檢驗 (包括無菌檢查) ”。筆者從無菌制劑的特殊性、無菌檢查方法的局限性、無菌保證水平、無菌產(chǎn)品的工藝設(shè)計、無菌安全的保證要素幾個方面探討提高無菌安全水平的對策，以完善產(chǎn)品的質(zhì)量保證體系，保證藥品的質(zhì)量、療效和用藥安全。
無菌制劑的特殊性
無菌物品是指物品中不含任何活的微生物， 實際上無法證明產(chǎn)品中沒有活的微生物存在， 因為對于任何一批滅菌物品而言， 絕對無菌既無法保證也無法用實驗來證實。一批物品的無菌特性只能通過對物品中活的微生物的概率低至某個可接受的水平來表達， 即無菌保證水平 ( sterility assurance level， SAL) 。實際生產(chǎn)過程中，滅菌是指將物品中污染的微生物概率降至預期的無菌保證水平。最終滅菌物品微生物存活概率，即無菌保證水平不得高于 10-6。無菌制劑的生產(chǎn)是一個完整的操作規(guī)則體系， 若其中的任何環(huán)節(jié)被疏忽、 被污染，那么其他環(huán)節(jié)雖是無菌操作， 也將完全失去意義，都可能導致藥品生產(chǎn)不符合質(zhì)量要求。
無菌檢查法的局限性
無菌檢查法是根據(jù)《中華人民共和國藥典》 內(nèi)容而建立的一種檢查方法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。檢驗結(jié)果只是基于“可能性” 的判斷 ， 無菌檢查方法的局限性在于以下幾個方面。
1培養(yǎng)液的質(zhì)量
無菌檢查所用的培養(yǎng)液只是針對真菌和細菌的檢驗， 對結(jié)果的判斷也是基于“是否在培養(yǎng)液中生長”。
2培養(yǎng)條件
研究表明，《中華人民共和國藥典》 規(guī)定的微生物培養(yǎng)條件并不是許多細菌和真菌的最適生長條件 。
3實驗驗證
微生物的生長除了受培養(yǎng)液的質(zhì)量、培養(yǎng)條件( 溫度、時間) ， 還要受檢品特性如檢品有無抑菌作用、 供試品的處理方法及實驗操作條件等因素的影響，因此要保證無菌檢查結(jié)果的準確性和可靠性就必須對無菌檢查的方法進行驗證。
4檢驗數(shù)量
《中華人民共和國藥典》 規(guī)定無菌檢查是抽樣檢查，一般是從每批產(chǎn)品中抽取一定數(shù)量的單位產(chǎn)品組成樣本進行無菌檢查， 以此判斷整批產(chǎn)品是否符合無菌的要求。無菌產(chǎn)品的污染率(q) 、 無菌檢查的取樣量(n) 以及無菌檢查通過的概率( p) 之間的關(guān)系可以用如下數(shù)學公式表示: pn = (1-q) n。當固定污染率為 0.1%，抽樣 30 瓶時通過無菌檢查的通過率為( 1-0.001) 30 = 97.0%， 檢出染菌的概率為3.0%; 抽樣 100 瓶時， 通過無菌檢查的通過率為( 1-0.001) 100 = 90.5%， 檢出染菌的概率為 9.5%; 抽樣1 000瓶時，通過無菌檢查的通過率為(1-0.001) 1.000 = 36.8%，檢出染菌的概率為 63.2%。
當固定 30 瓶取樣量， 假定該產(chǎn)品的污染率為 1.0%，通過計算，該批產(chǎn)品通過無菌檢查的通過率為 74%; 如果該產(chǎn)品的污染率為 0.5%，則通過無菌檢查的通過率為 86%。通過以上數(shù)據(jù)可以看出: 樣本污染微生物的比例越低， 抽樣樣本通過無菌檢查的通過率就越高，即使增大抽樣量也很難檢查出污染的部分。因為無菌檢查法是一項破壞性實驗，因此不可能對整批產(chǎn)品進行 100%的檢驗，基于抽樣檢驗的無菌檢查，存在的局限性是很明顯的。雖然產(chǎn)品的無菌檢查按《中華人民共和國藥典》 規(guī)定檢查合格，但不能得出產(chǎn)品絕對無菌的結(jié)論，這已是一個共識。
無菌保證水平
2010 版《中華人民共和國藥典》 將終端產(chǎn)品的無菌保證要求規(guī)定為微生物污染概率不超過百萬分之一，而采用無菌制造工藝，其無菌保證水平則為微生物污染概率不超過千分之一。以過濾除菌法為例。過濾除菌法：常用于氣體 熱不穩(wěn)定的藥品液體或原料的除菌。
過濾過程中無菌保證與過濾液體的初始生物負荷及過 濾器的對數(shù)下降值 ( log reduction value，LRV) 有關(guān)，LRV 系指規(guī)定條件下，被過濾液體過濾前的微生物數(shù)量與過濾后的微生物數(shù)量比的常用對數(shù)值。即: LRV = LgN0-LgN。式中: N0 為產(chǎn)品過濾前的微生物數(shù)量，N為產(chǎn)品過濾后的微生物數(shù)量。每平方厘米有效過濾面積的 LRV 可以達到 7， 即過濾器上游每平方厘米有107個菌，下游可以達到 1個菌的水平。
除菌過濾器本身的除菌效率可以達到10-7水平，但是，由于人員操作及環(huán)境因素的影響， 產(chǎn)品最終的無菌保證一般只能達到10-3 水平， 遠遠低于除菌過濾本身的水平。此外除菌過濾器不能將病毒或支原體全部濾除，所以對于除菌過濾法，其生產(chǎn)系統(tǒng)應嚴格符合無菌生產(chǎn)的 GMP 要求。GMP2010 年修訂附錄 1無菌藥品第五十二條: 應當盡可能減少物料的微生物污染程度。
第五十八條: 應當根據(jù)所用滅菌方法的效果，確定滅菌前產(chǎn)品微生物污染水平的監(jiān)控標準，并且定期監(jiān)控。因此《藥品 GMP 指南》 ( 無菌藥品，2010 年修訂) 在第 6 節(jié)藥液的配制中提出: 對于固體溶解并進行無菌過濾的產(chǎn)品而言， 起始物料的微生物污染水平應進行控制，通常為100 cfu·g-1[菌落形成單位數(shù)(colony forming units，cfu)]，除菌過濾前非最終滅菌產(chǎn)品的微生物限度標準一般為 10 cfu /100 mL。
無菌產(chǎn)品的工藝設(shè)計
無菌生產(chǎn)工藝就是必須在無菌控制條件下生產(chǎn)無菌制劑的方法，無菌產(chǎn)品分兩大類即無菌分裝的產(chǎn)品和最終滅菌的產(chǎn)品。無論是哪一類無菌產(chǎn)品， 無菌生產(chǎn)工藝都應嚴密監(jiān)控生產(chǎn)環(huán)境的潔凈度， 并應在無菌控制的環(huán)境下才能操作。采用無菌生產(chǎn)工藝， 首先在劑型的選擇上應選擇無菌保證水平高的劑型。如果主藥在水中穩(wěn)定，但不能耐受濕熱滅菌，則不宜開發(fā)成大容量注射劑，可以開發(fā)成小容量注射劑或凍干粉針，因為采用無菌生產(chǎn)工藝制備大容量注射劑因灌裝時間長，染菌的風險就大大提高。在其生產(chǎn)過程中，應定期對無菌生產(chǎn)工藝進行驗證， 驗證內(nèi)容包括環(huán)境空氣過濾系統(tǒng)有效性、工藝用水系統(tǒng)、設(shè)備和人員清潔及培養(yǎng)液模擬灌裝實驗等。
無菌安全的保證要素
無菌安全實際上就是避免染菌， 如果在生產(chǎn)過程中能避免已滅菌的容器設(shè)備等受到二次污染就能保證產(chǎn)品的無菌安全。微生物的來源主要有以下 3 種。
1人員
人是潔凈區(qū)環(huán)境的最大污染源， 因為人員幾乎涉及到所有的生產(chǎn)步驟，人員的活動量將直接影響整個潔凈區(qū)的環(huán)境質(zhì)量，在無菌室由操作人員引起的污染將達到總污染原因的 95% 。研究表明，潔凈室內(nèi)的工作人員穿無菌服時，靜止狀態(tài)的發(fā)菌量一般為每人每分鐘 10 ～ 300 個， 軀體一般活動狀態(tài)為每人每分鐘150～1 000 個，快步行走狀態(tài)為每人每分鐘 900 ～ 2 500個，咳嗽一次一般為每人每分鐘 70～700 個，噴嚏一次一般為每人每分鐘 4 000 ～ 62 000 個。通過對上海地區(qū)無菌藥品生產(chǎn)企業(yè)的核心生產(chǎn)區(qū)( 即動態(tài) A /B 或 A /C級) 環(huán)境中微生物的污染采樣，共收集到微生物分離株265 株，A 級區(qū)共收集到 63 株， 占污染微生物總數(shù)的23.8%，在 A 級區(qū)的微生物污染物類型較多、 較復雜。不同潔凈級別區(qū)域之間的空氣微生物污染程度由低級別向高級別遞減，但表面微生物污染程度在各潔凈級別之間的差異不大。這說明空氣凈化和物理隔離可以有效阻斷大部分微生物的傳播，但接觸和操作引起的污染仍是生產(chǎn)企業(yè)面臨的主要問題。
2工藝用水
注射用水與注射劑在生產(chǎn)過程中污染可能性最高的發(fā)熱性物質(zhì)就是細菌內(nèi)毒素。細菌內(nèi)毒素由革蘭陰性菌產(chǎn)生， 而水源性微生物絕大多數(shù)為革蘭陰性菌，這類微生物不會形成芽孢， 故不耐熱， 通過滅菌手段可將其殺死， 但該類細菌的細胞壁外層上有一層特殊的結(jié)構(gòu)， 它在細菌生長繁殖過程中并不分泌到介質(zhì)中，也不能從外壁上自然脫落，不是細菌的代謝產(chǎn)物，當細菌死亡、解體后才顯示出一系列內(nèi)毒素的生物活性。細菌內(nèi)毒素具有耐熱性， 需用干熱滅菌(250 ℃，30min 以上)才能去除。細菌內(nèi)毒素會使人致病甚至死亡，對藥品質(zhì)量產(chǎn)生不良的影響。
3環(huán)境
空氣中的微生物基本為革蘭陽性菌，根據(jù)有關(guān)的資料報道 : 人葡萄球菌和唾液鏈球菌為人體攜帶的常見菌種，而沃氏葡萄球菌、藤黃微球菌和芽孢桿菌均為常見環(huán)境菌。產(chǎn)生芽孢的細菌都是革蘭陽性菌 ，芽孢對熱、干燥、輻射、化學、消毒劑等理化因素均有強大的抵抗力，其中含有吡啶二羧酸鈣，更增加了對熱的抵抗力。如果芽孢被環(huán)境中的塵埃包圍， 這類芽孢的耐熱性可能會更強，更不易被殺死。
提高無菌安全水平的對策
1重視無菌檢查法的方法學驗證
無菌檢查法常見的問題： 對檢驗方法的驗證、 培養(yǎng)時間的選擇和結(jié)果判斷缺乏系統(tǒng)的評價。所以，應綜合分析實驗中遇到的所有情況，最終形成一份詳細的、嚴謹、具有可操作性的驗證報告，并且建立該品種的標準操作規(guī)程( standard operation procedure， SOP) ，在規(guī)程中應對樣品的取樣量、無菌檢查方法的選擇、集菌培養(yǎng)器的型號、稀釋劑及沖洗液的選擇、每次沖洗液的用量和沖洗次數(shù)都應有說明。研究表明， 同一品種使用適于抗菌性供試品專用培養(yǎng)器( KSF330， 0.45 μm) 比使用適于非抗菌性供試品普通培養(yǎng)器 ( CN330， 0.22 μm;PY330，0.45 μm) 所需沖洗量少一半; 不同的品種所需的沖洗量不同，選擇不同的沖洗液所需的沖洗量不同。對待無菌檢查結(jié)果要進行科學分析， 如果無菌檢查結(jié)果合格，不能得出該批產(chǎn)品絕對無菌的結(jié)論，如果無菌檢查不合格，則可以判定該批產(chǎn)品染菌的結(jié)論。不能出現(xiàn)假陰性( 陽性對照為陰性) 時漏檢， 當結(jié)果為陽性時，違反《中華人民共和國藥典》 規(guī)定進行復檢。
2全面、細致、周到的質(zhì)量管理
目前已經(jīng)過了 GMP認證的無菌制劑生產(chǎn)企業(yè)，均建立了完善的質(zhì)量管理體系和一系列管理制度。但任何一項規(guī)章制度都無法阻止違規(guī)現(xiàn)象的發(fā)生，能否有效執(zhí)行是關(guān)鍵。在生產(chǎn)中可能會出現(xiàn)很多違規(guī)現(xiàn)象，但是在管理方面卻沒有任何的證據(jù)。例如對傳遞窗使用的管理，傳遞窗的作用就是防止物品在傳遞過程中受到污染和避免交叉污染，對傳遞窗的使用有幾個要求: 傳遞窗的自凈時間、 紫外線的照度及照射時間。而現(xiàn)在多數(shù)的傳遞窗的按鈕設(shè)置就是一個最基本的電源開關(guān)，工作人員自行操作時會嚴格按標準操作規(guī)程執(zhí)行嗎? 如自凈時間確認為30 min，有些操作人員為了趕時間， 只用15 min。再例如， 對于無菌操作間，進入人員的數(shù)量是有嚴格規(guī)定的， 但有時車間為了趕進度或由于其他原因可能會增加人數(shù)，這些操作都是違規(guī)的，所以為了能全面、細致、周到地執(zhí)行和實施GMP，建議從以下幾個方面進行改進。
人員培訓
GMP 培訓是提高藥品生產(chǎn)企業(yè)人員素質(zhì)的有效手段， 人員素質(zhì)的不斷提高是保證藥品質(zhì)量的基礎(chǔ)。應對員工開展各類培訓， 對不同員工所在崗位需要掌握的知識和技能進行針對性培訓， 對培訓效果進行考核。保障員工掌握本崗位的基本理論知識、 操作規(guī)程和實際操作技能。同時，要經(jīng)常對員工進行藥害事件的宣傳教育工作，增強責任心，使其在工作中自覺地按照標準操作規(guī)程操作 。無菌藥品的微生物污染是影響藥品生產(chǎn)質(zhì)量和引發(fā)不良反應事件的主要因素之一。微生物是無處不在、 無孔不入的， 反復進行無菌概念的培訓是加強無菌概念的有效辦法。反思現(xiàn)行的無菌培訓， 內(nèi)容多是微生物學和進出潔凈室的規(guī)程，由于操作規(guī)程中不可能事無巨細，員工在實際生產(chǎn)中遇到規(guī)程中沒有規(guī)定的情況， 常常會違反無菌操作的原則[ 11] 。特別要加強對外部施工人員和維修人員的培訓工作， 當他們在生產(chǎn)期間需進入生產(chǎn)潔凈區(qū)時應當對其進行詳細的指導和監(jiān)督。在實際生產(chǎn)中，往往會出現(xiàn)這樣的情況， 當設(shè)備出現(xiàn)小故障時， 為了使生產(chǎn)能正常進行，或者出于迫切完成任務(wù)的考慮，維修人員會做出一些違規(guī)動作， 如果沒有較強的無菌
概念，就會導致污染。
工藝用水
有效控制水系統(tǒng)的微生物污染水平及細菌內(nèi)毒素的水平， 企業(yè)內(nèi)部應設(shè)立警戒水平及糾偏限度，以便及時發(fā)現(xiàn)不良趨勢，采取相應措施。
環(huán)境管理
環(huán)境管理的主要思想是防止污染和交叉污染。生產(chǎn)環(huán)境包括: 空氣、 設(shè)備、 設(shè)施以及操作人員。環(huán)境監(jiān)測是用來評估生產(chǎn)環(huán)境控制是否有效的一個工具。檢測項目包括懸浮粒子、 空氣浮游菌、 沉降菌、 設(shè)備和設(shè)施表面的微生物以及操作人員的衛(wèi)生狀況監(jiān)測等。環(huán)境中懸浮粒子的有效控制， 在很大程度上解除了塵埃包裹芽孢的可能， 避免了難以滅菌的風險。沉降菌、 浮游菌及表面微生物這 3 種監(jiān)測的原理是不同的，針對不同的微生物， 不能完全相互替代。通過對潔凈室 /區(qū)空氣、 設(shè)備、 設(shè)施表面以及操作人員表面微生物的采集， 除了通過菌落計數(shù)了解微生物的濃度外，還應包括對培養(yǎng)出來的污染微生物進行鑒別，通過鑒別可了解潔凈室的清潔、 消毒步驟的有效性或缺陷性，特別是對消毒劑有效性評估有所幫助，微生物鑒別的結(jié)果也對調(diào)查和消除污染源有幫助。
設(shè)備的管理
在企業(yè)的生產(chǎn)過程中，設(shè)備與設(shè)施如同戰(zhàn)場上的武器一樣，平時必須要注重保養(yǎng)和維護，并且要制定有效的短、 中期維修計劃，確保設(shè)備正常運行，這樣才能在實際操作中發(fā)揮良好的作用，不會給生產(chǎn)帶來負面影響。
3注重無菌生產(chǎn)工藝驗證
要定期進行培養(yǎng)液模擬灌裝驗證，證明經(jīng)過完整的生產(chǎn)過程，產(chǎn)品污染率的目標為零。培養(yǎng)液模擬灌裝在某種意義上是一種挑戰(zhàn)性實驗，使用培養(yǎng)液作為藥品的替代品進行無菌模擬生產(chǎn)，對無菌工藝進行驗證。因為幾乎在所有情況下，微生物在培養(yǎng)液中的繁殖和生長比在實際產(chǎn)品中更容易。GMP( 2010 年修訂) 附錄 1 無菌藥品中第四十七條提出: 培養(yǎng)液模擬灌裝實驗的首次驗證，每班次應當連續(xù)進行 3 次合格實驗， 空氣凈化系統(tǒng)、 設(shè)備、 生產(chǎn)工藝及人員重大變更后，應當重復進行培養(yǎng)液模擬灌裝實驗，培養(yǎng)液模擬灌裝實驗通常應當按照生產(chǎn)工藝每班次半年進行一次，每次至少一批。
4現(xiàn)場監(jiān)督
現(xiàn)場監(jiān)督是質(zhì)量保證(quality assurance，QA) 的一部分。QA就是為了滿足品質(zhì)的要求而進行的全面有效的質(zhì)量管理活動。QA人員的主要職責就是對生產(chǎn)全過程進行控制， 糾正生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的差錯及不規(guī)范行為， 做到防患于未然。QA人員工作的性質(zhì)就是要找別人的缺點與不足，為了起到警示作用還必須對不規(guī)范行為進行扣罰。QA人員最容易犯的錯誤就是遇見問題總是搬出文件規(guī)定，命令操作人員執(zhí)行，當生產(chǎn)過程中出現(xiàn)異常情況時也只會讓操作人員停下來并且一味強調(diào)要如何處分或者威脅當事人，這樣說和做的結(jié)果不僅不能解決問題，反而會增加當事人對QA人員的反感， 以后 QA人員的管理工作會更難開展。
更可怕的是操作人員會有意隱瞞生產(chǎn)現(xiàn)場的任何問題， 這樣一來質(zhì)量風險會越來越大。GMP 規(guī)范和《中國人民共和國藥典》的標準是不可逾越的，為此需要尋找各種可行的辦法， 所以要求 QA人員必須具有理論知識和實踐經(jīng)驗，既精通GMP法規(guī)，熟知生產(chǎn)工藝，又要懂得設(shè)備的操作，并且還要具有良好的與人溝通的能力。在現(xiàn)場發(fā)現(xiàn)問題時，QA人員能和操作人員共同分析問題， 從根本上幫助操作人員解決問題， 得到操作人員的理解和尊重，這樣才能使QA工作進入良性循環(huán)。
